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防脱玻片|BCA试剂盒|ECL发光液|RIPA裂解液|4%多聚甲醛|上海威奥生物科技有限公司

    固相载体表面(如ELISA板,NC膜或者PVDF膜上等)有很多洞洞,通过电转或包被,胶上的蛋白被转移到了膜上,或抗原/抗体固定在板上,蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面,但蛋白并不是连续的,有很多空隙,而且比如说样品孔之间也有空隙,这些洞洞并没有填进东西,而抗体也是蛋白,也会被吸附在空的洞里,这样,就会有很多非特异性的信号。封闭液中的蛋白可以与表面上的空白位置结合,同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上,因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合,所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样,抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上,而只会跟特异性蛋白结合。封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

    封闭所用试剂:

    1、BSA

    BSA是最常用的封闭剂,成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的, BSA有很强的免疫原性,会导致产生很多的针对BSA的抗体,为避免交叉反应,不能用BSA、脱脂奶粉等封闭,可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭剂封闭。
    大部分BSA中有少量的抗体残留,会导致抗原/抗体之间的交叉反应,产生高背景,杂带较多或使得本底水平增高。

    2、血清

    封闭血清的原理主要有两点,第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质,从而导致背景过高,因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合,从这点看,BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体,可以和抗体恒定区结合,与抗体特异性无关,封闭血清中有抗体,因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。
    免疫组化中用血清封闭的较多。封闭血清一般选择和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合, 会造成背景。但要注意封闭用血清中不能含有目标蛋白,且与一抗来源不同。另外二抗因尽量少选取兔子或老鼠来源的,因为这两个在亲缘关系上和人类非常接近,所以产生交叉反应的机会就比较大,从而导致背景比较高。!适合选用来源于驴,山羊,绵羊等的二抗,背景相对就很低。

    3、脱脂奶粉

    脱脂奶粉最大的优点是价钱便宜,所以是首选,但是由于成分相对复杂,所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加,此外,因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。
    奶粉蛋白种类比BSA多,而WB膜也好,ELISA板也好,表面的微结构都不是那么均匀的,相对而言,不同分子量蛋白种类多的奶粉(BSA只是一种蛋白),封闭起来更全面。
    脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留,在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时,也会使得高背景或本底水平增高。由于奶粉的成份复杂,而且封闭后的载体不易长期保存,因此在试剂盒的制备中较少应用。

    4、酪蛋白

    和BSA作用类似,普通酪蛋白不易溶解。中性和碱性条件下带有负电性,与同样带负电荷胶体金之间存在排斥力,而膜一般都是带正电荷,会与酪蛋白有一定的吸附作用,用酪蛋白封闭效果好些。

    5、无蛋白化合物

    甲醛:与PVDF膜表面的微结构反应或者结合,使之失去结合蛋白的疏水力或者空间结构域。

    去污剂(吐温-20):有抗原修复的作用,与膜疏水性吸附,有很强的对非特异性吸附的洗脱作用,同样可以降低蛋白间的疏水作用,可提高特异性抗体的识别能力。

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